用于快速miRNA检测的灵敏一锅ROA 测定
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2024-04-24 14:46:00
摘要 这项研究由阮珏教授(中国农业科学院，中国深圳)领导。作者开发了一种基于滚环扩增(RCA)的一锅等温检测方法，用于快速特异性检测 miRNA 和...
这项研究由阮珏教授(中国农业科学院，中国深圳)领导。作者开发了一种基于滚环扩增(RCA)的一锅等温检测方法，用于快速特异性检测 miRNA 和短 RNA 片段。该方法集目标识别、线性滚环扩增(线性RCA)、引物生成于一管中，检测时间可缩短至1 h以内。此外，ROA 具有高度灵敏度，检测限 (LOD) 达到 6pM。结果易于目视读取，并经验证与 RT-PCR 一样准确。
ROA的原理如下。首先，设计用于测试 miRNA 的环形探针。检测过程中，环形探针在 57°C-60°C 下与目标 miRNA 特异性结合。一般情况下，滚环扩增是在Bst聚合酶的作用下进行的。这里我们还通过加入一定比例的dUTP和识别U的限制性内切酶，人为地做了一个U-nick反应。这样的话，反应体系中新生成的DNA单链就会被UDG打断，并不断触发新的DNA单链。滚环扩增作为新的引物，将促进检测在短时间内实现指数扩增。最后，我们使用SYBR Gold作为指示剂，快速检测荧光信号。 ROA 可以在 1 小时内将模板从皮克 (pg) 级别放大到微克 (μg) 级别。 ROA在测试18至24 nt不同长度的miRNA时表现出优异的适应性。在特异性测试中，发现ROA对单核苷酸错配敏感，特别是在3'端。与其他UDG辅助的RCA相比，ROA具有更好的特异性。
我们进一步探索ROA对RNA病——MS2噬菌体的检测能力。结果发现，即使不去除宿主，ROA也能有效检测MS2噬菌体的靶RNA。它证明了这种 ROA 测定在方便、快速检测病方面的明显潜力。
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